Prinsip dan Prosedur Kerja Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang penting untuk identifikasi bakteri. Teknik pewarnaan ini termasuk differential stain atau pewarnaan bertingkat yang menggunakan lebih dari satu jenis pewarna. Mula-mula apusan sel bakteri yang telah difiksasi dengan panas diberi pewarna kristal violet, kemudian ditambahkan iodin yang berfungsi sebagai mordant (zat kimia yang berfungsi mempertahankan zat pewarna). Tahap selanjutnya adalah dekolorisasi menggunakan alkohol 95% dan pewarnaan kembali atau counterstaining dengan safranin.

Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Di bawah mikroskop bakteri Gram-positif akan tampak berwarna ungu-violet sedangkan Gram-negatif akan terlihat berwarna pink. Contoh dari bakteri Gram-positif adalah Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Staphylococcus, dan Streptococcus. Sementara itu Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, dan Moraxella merupakan contoh dari bakteri Gram-negatif. Dari gambar di samping dapat dilihat bakteri berbentuk batang merupakan Gram-negatif sedangkan bakteri berbentuk coccus merupakan Gram-positif.

Teknik pewarnaan Gram didasarkan atas perbedaan struktur dinding sel kedua jenis bakteri tersebut. Dinding sel bakteri Gram-positif hanya terdiri dari satu lapisan tebal yang tersusun dari satu jenis molekul saja. Sementara itu Gram-negatif memiliki dua lapis dinding sel, yaitu lapisan peptidoglikan yang relatif lebih tipis dan membran luar. Dinding sel Gram-positif 90 % nya merupakan peptidoglikan sedangkan hanya 10-20 % dinding sel bakteri Gram-negatif yang tersusun atas peptidoglikan, sisanya merupakan polisakarida, lipid, dan protein yang menyusun membran luar. Oleh karena itu membran luar disebut juga sebagai lapisan lipopolisakarida (LPS).

Pada tahap pertama pewarnaan Gram, kompleks kristal violet-iodine yang bersifat insoluble akan terbentuk. Setelah penambahan alkohol, kompleks kristal ini akan terekstraksi pada bakteri Gram-negatif namun tidak pada Gram-positif. Hal ini terjadi karena Gram-positif memiliki dinding sel peptidoglikan yang sangat tebal, sehingga ketika didehidrasi dengan alkohol pori dinding sel akan menutup dan menjaga kompleks kristal violet-iodine tetap di dalam sel. Sementara itu pada Gram-negatif, alkohol dapat dengan mudah memasuki membran luar yang didominasi lipid dan mengekstraksi kompleks kristal tersebut. Setelah dekolorisasi dengan alkohol, bakteri Gram negatif akan terlihat bening. Oleh karena itu perlu dilakukan pewarnaan kembali dengan pewarna kedua yakni safranin.

Karakteristik	Gram positif	Gram negatif
Peptidoglikan	Tebal	Tipis
Teichoic acid	Terkadang ada	Tidak ada
Lipid	Sangat sedikit	Lipopolisakarida
Membran luar	Tidak ada	Ada
Periplasmic space	Tidak ada	Ada
Bentuk sel	Selalu rigid	Rigid atau fleksibel
Hasil disgesti enzim lysozyme	Protoplas	Spheroplas
Sensitivitas terhadap zat pewarna dan antibiotik	Sangat sensitif	Sensitif

Selain bakteri Gram positif dan negatif, ada pula yang disebut dengan Gram-nonreactive dan Gram-variable. Gram-nonreactive adalah yang organisme tidak dapat terwarnai atau terwarnai dengan buruk menggunakan teknik ini. Spesies dalam kategori ini berasal dari grup taksonomi yang berbeda dengan bakteri Gram-positif dan negatif. Sementara itu Gram-variable adalah organisme yang kehilangan kemampuannya untuk bereaksi dengan pewarna Gram sehingga hasil pewarnaannya tidak merata, warnanya merupakan percampuran ungu-violet dengan pink atau terlihat ada dua warna meskipun hanya satu spesies yang diuji. Umumnya organisme berumur lebih dari 48 jam akan menjadi Gram-variable ketika diwarnai. Oleh karena itu untuk mengecek jenis organisme dengan teknik ini sebaiknya menggunakan kultur sel bakteri berumur 18-24 jam.

_______
Penulis: Nisaa Adn'ain

Referensi:

Black, Jacquelyn G. 2008. Microbiology Principles and Explorations 7th Ed. Danvers: John Wiley & Sons Inc.

Sumber https://www.generasibiologi.com/

Bagikan Artikel ini